應(yīng)該用什么孔徑的微孔濾膜富集腫瘤細胞？
導(dǎo)讀:天津津騰對不同孔徑微孔濾膜富集腫瘤細胞進行研究。分別測定活性K562細胞、固定的K562細胞及血液樣本通過孔徑為1、3、5、8、10μm濾膜的濾過率。
來源：未知
發(fā)布日期：2019-11-12 09:53【大 中 小】
天津津騰實驗設(shè)備有限公司認(rèn)為由于循環(huán)腫瘤細胞在血液中含量很少，與白細胞、紅細胞相差懸殊，這又給循環(huán)腫瘤細胞的檢測帶來極大的困難與挑戰(zhàn)，因此循環(huán)腫瘤細胞的富集就非常重要。現(xiàn)有的富集方法主要包括免疫磁分離法、梯度離心法、微流控技術(shù)以及膜濾過分離法等。但是，前兩種富集方法假陽性假陰性高、敏感性差;微流控技術(shù)靈敏度較高，但成本高;而基于細胞大小的膜濾過分離技術(shù)與微流控原理類似，具有操作簡單、檢測成本低、敏感性高等特點，在臨床應(yīng)用中極具優(yōu)勢?，F(xiàn)有的針對膜過濾富集循環(huán)腫瘤細胞的方法多采用8μm濾膜，對于8μm以下濾膜的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞可穿過孔徑比其自身直徑小很多的濾膜，因此天津津騰進一步研究多種濾膜孔徑與腫瘤細胞回收率之間的關(guān)系，以探索更理想的膜過濾富集循環(huán)腫瘤細胞方法。
1材料和儀器
K562細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心)，可換膜過濾器(北京凱樂思公司)，不同孔徑(1、3、5、8、10μm)微孔濾膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)，10mL注射器(上海治寧公司)，IX熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，DT5-1離心機(北京時代北利離心機公司)，ＲPMI1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)，結(jié)晶紫溶液(北京鼎國盛公司)，紅細胞裂解液(北京凱樂思科技有限公司)。
2細胞濾過率的測定
活性及固定的K562細胞濾過率的測定:分別取濃度為7.2×105～7.4×105/mL的活性的K562細胞及固定后的K562細胞200μL，通過1、3、5、8、10μm津騰微孔濾膜。1mL血液濾過率的測定:分別取1mL靜脈血與裂解液按照1:10的比例混勻，8min后離心洗滌，再通過1、3、5、8、10μm津騰微孔濾膜;重復(fù)以上實驗3次，計算每個樣本濾過率:活性K562細胞濾過率(%)=回收液中活性K562細胞個數(shù)/實際所加活性K562細胞個數(shù)×100%，固定K562細胞濾過率(%)=回收液中固定K562細胞個數(shù)/實際所加固定K562細胞個數(shù)×100%，1mL血液的濾過率(%)=回收液中白細胞個數(shù)/實際所加1mL血液中白細胞個數(shù)×100%。
3結(jié)果
活性K562細胞、固定K562細胞及血液通過不同孔徑的津騰微孔濾膜濾過率及時間的結(jié)果?；钚约肮潭↘562細胞通過1、3、5、8、10μm津騰微孔濾膜后，隨著濾膜孔徑增大，濾過率逐漸增大，活性的K562細胞濾過率明顯大于固定后的K562。活性K562細胞及固定染色后的K562細胞均可穿過5、8、10μm濾膜，不能穿過1μm濾膜，固定K562細胞不能穿過3μm濾膜。同時，將1mL血液樣本分別通過1、3、5、8、10μm津騰微孔濾膜，8和10μm的濾過率為64%左右，1、3、5μm濾膜的濾過率分別為0%、16.48%、44.23%。固定K562細胞過濾時濃度與時間的關(guān)系。使用不同濃度固定染色的K562細胞，分別通過1和3μm濾膜，相同條件下，使用1μm濾膜的過濾時間顯著性大于3μm濾膜過濾的時間顯著性(P＜0.01)。
4討論
實際臨床循環(huán)腫瘤細胞的大小在10μm以上，而固定的K562細胞的直徑約為12μm，活性的K562細胞約為13μm，K562細胞與其他細胞系相比直徑較小，但也在10μm以上，因此本實驗采用與實際腫瘤細胞的大小相差不多的K562細胞進行富集的研究，從而可以更好地選出一種合適孔徑的濾膜，以去除直徑較小的白細胞，保留直徑較大的腫瘤細胞。本實驗天津津騰認(rèn)為首先檢測活性和固定的K562及血液通過不同津騰微孔濾膜的濾過率，選出1μm及3μm孔徑濾膜用于腫瘤細胞的富集，同時結(jié)合1μm與3μm濾膜在過濾細胞的時間效率，進一步確定了3μm的微孔濾膜富集腫瘤細胞系。
5結(jié)論
本實驗天津津騰實驗設(shè)備有限公司發(fā)現(xiàn)其研究活性K562細胞、固定K562細胞及血液樣本通過微孔濾膜的濾過情況，選取孔徑為3μm的聚碳酸酯濾膜來完成循環(huán)腫瘤細胞的富集，同時檢測不同條件下固定的腫瘤細胞通過3μm微孔濾膜的回收率及陽性率，為今后的臨床腫瘤患者血液樣本通過微孔濾膜富集并檢測CTC提供了可行性的研究。但是，考慮到每毫升血液中CTC含量較少，僅為1～10個，而人體外周血來源容易，因此在完成實際臨床樣本檢測時，可考慮檢測較大量的樣本，比如3mL血樣，增加檢出的回收率及陽性率，進一步確立從外周血富集回收腫瘤細胞的方法。
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